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冰冻切片
 

关键词:病理切片  组织切片  免疫荧光  病理组织切片  病理染色  免疫荧光染色



实验方法原理:冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂,将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程,大大缩短了制片时间。同时,由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤,因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片,并作为快速切片的方法应用在临床诊断。


冰冻切片机

实验材料:新鲜组织

试剂、试剂盒:H2O2酒精丙酮PBSDAPI工作液中性树胶

仪器、耗材:OCT速冻架恒冷箱切片机烘箱荧光显微镜


冰冻切片可用于免疫荧光

实验步骤

一取材

应尽可能快地采取新鲜的材料,防止组织发生死后变化。

二速冻

1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2cm)。

2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。

3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮中,大约10-20s组织即迅速冰结成块。

4、在制成冻块后,即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。

5、若需要保存,应快速以铝箔或塑料薄膜封包,立即置入-80℃冰箱贮存备用。

三固定

1、样品托上涂一层OCT包埋胶,将速冻组织置于其上,4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。

2、取下组织置于锡箔或者玻片上,样品托速冻。

3、组织置于样品托上,其上再添一层OCT胶,以完全覆盖为宜,速冻架(PE)上30min。

四切片

1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机,其基本结构是将切片机置于低温密闭室内,故切片时不受外界温度和环境影响,可连续切薄片至5-10μm。

2、切片时,低温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜,温度过低组织易破碎,抗卷板的位置及角度要适当,载玻片附贴组织切片,切勿上下移动。

3、切好室温放置30min后,入4℃丙酮固定5-10min,烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。

4、进行抗原热修复,微波热修复也可,室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10min,消除内源性过氧化物酶的活性。

五免疫荧光染色

1、冰冻切片室温晾干15min,可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时(此步可不洗)。

2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液(抗体的量视组织大小而定,原则是可以均匀覆盖组织面,且保证整个过程中不会使组织干涸)。

3、将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒,室温孵育2小时或4℃过夜。

4、第二天先将湿盒放到37℃回温1h,然后吸取片上的一抗进行回收,将切片插入到小染缸PBS冲洗。

5、滴加用PBS稀释好的二抗(避光)置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗,切片置于染缸内,PBS洗5min×3次。

6、滴加DAPI工作液染核,室温10-20min(工作浓度0.1%染色15min)。

7、回收DAPI,滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶,用处理干净的盖玻片封片,即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。

8、做好的切片放在切片盒内,置于4℃冰箱,可保存一周左右。