细胞生物学平台

细胞增殖是生物体的重要生命特征，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式产生新的细胞，用来补充体内衰老或死亡的细胞。细胞实验中原代细胞和肿瘤细胞株均有增殖能力，为检测研究的药物或者基因的变化对细胞的增殖的影响，一般会使用MTT检测、CCK8检测、BrdU染色、EdU染色等实验。
1 MTT检测
MTT 是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在 570nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。适合贴壁细胞，不适合悬浮细胞检测。
实验流程：
1.1、使用血球计数板对细胞计数计数，接种3000-5000个细胞至96孔板，轻轻摇晃均匀后放入培养箱培养过夜；
1.2、根据实验目的进行加药或其他处理；
1.3、细胞培养到指定时间点后，加入10μl MTT溶液，轻轻混匀后放入培养箱中培养3h；
1.4、去除培养基，加入DMSO溶液，轻轻摇晃将96孔板放入酶标仪检测。
2 CCK8检测
Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，是一种类似于MTT的化合物，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物（formazan）。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。悬浮细胞和贴壁细胞均可以进行检测。
实验流程：
2.1、使用血球计数板对细胞计数计数，接种3000-5000个细胞至96孔板，轻轻摇晃均匀后放入培养箱培养过夜；
2.2、根据实验目的进行加药或其他处理；
2.3、细胞培养到指定时间点后，加入10μl CCK8溶液，轻轻混匀后放入培养箱中培养2-4h；
2.4、将96孔板放入酶标仪检测。
3 BrdU染色检测
BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）是胸腺嘧啶的衍生物，常用于标记活性中新合成的DNA，可代替胸腺嘧啶选择性整合到复制细胞中新合成的DNA中（细胞周期S期）。随着DNA复制可以可以进入子细胞中，BrdU特异性抗体可以用于检测BrdU的掺入，从而判断细胞的增殖能力。
EdU和BrdU类似，另一种胸腺嘧啶核苷类似物。它也能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶（T）渗入正在复制的DNA分子，通过基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EdU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。具体操作和BrdU类似。
实验流程：
3.1、接种5×10⁵个细胞于玻璃底培养皿中，摇晃均匀后放入培养箱培养过夜，根据实验目的加入药物或其他处理。
3.2、制备适量50μM BrdU培养基，37℃，孵育2h。除去培养液，用PBS洗涤3次。
3.3、加入4%多聚甲醛常温固定10min。
3.4、将多聚甲醛去除，加入预冷的PBS洗3次，每次5min。
3.5、加入含0.5% Triton X-100的PBS，在冰上将细胞膜穿刺10min。
3.6、去除PBS-Triton，加入预冷的PBS洗3次，每次5min。
3.7、加入PBS-3%BSA，常温封闭30min。
3.8、将BrdU抗体按照1:100的比例稀释在PBS-1%BSA溶液中，去除封闭液后，加入一抗，室温孵育2h或者4℃孵育过夜。
3.9、去除一抗，加入PBS-0.35%Tween20，洗3次，每次5min。
3.10、将荧光二抗分别按照1:400比例稀释在PBS-1%BSA溶液中，去除PBS-T后，加入二抗，室温避光孵育1h。
3.11、去除二抗，加入PBS-0.35%Tween20，洗3次，每次5min。
3.12、加入100ng/mL DAPI溶液，室温避光孵育10min。
3.13、去除DAPI，加入PBS-0.35%Tween20，洗3次，每次5min。
3.14、加入防荧光淬灭溶液，4℃避光放置或直接在激光共聚焦显微镜拍照。
4 细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验是检测单个细胞增殖能力的实验方法。当一个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，形成克隆，每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.2-1mm之间，集落的大小和数量反应该细胞独立生存能力和增殖能力，从而该实验反应细胞增殖的情况。
实验流程：
4.1、接种500个细胞于六孔板中，轻轻混匀后放入培养箱中培养；
4.2、培养过夜后，根据实验目的加入药物或其他处理；
4.3、每隔3天更换一次培养基，培养2周后，去除培养基，加入PBS洗一次；
4.4、加入4%多聚甲醛或者乙醇固定10min，去除培养基，加入结晶紫染色液，常温染色20min；
4.5、加入PBS洗3次，将六孔板放入烘箱中烘干，对克隆进行计数和拍照。
 

图 细胞增殖能力实验检测
A MTT和CCK8检测图； B BrdU染色检测图及统计图； C 细胞克隆形成检测图及统计图