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细胞分选:流式分选与磁珠分选

关键词:细胞实验外包  细胞培养  实验室  干细胞 原代分离培养 原代细胞  第三方检测机构 流式检测

 

什么是细胞分选?

细胞分选(cell sorting)是根据细胞所具有的特性将某种特定的细胞亚群从混合的细胞样品中分离出来的一种技术,是细胞学研究的重要课题。在需要对某种特定的细胞进行功能分析时,如对细胞培养上清液通过ELISA分析检测细胞分子、细胞共培养检测细胞功能等研究都以获得高纯度的目的细胞为前提。
常用的细胞分选的方法有两种:流式细胞分选和免疫磁性细胞分选。



流式细胞分选

流式细胞分选是在流式细胞术检测细胞表型的基础上,使用充电分选技术以实现多种特定表型细胞的分离。具有分选参数多、群体多、纯度高、灵活性强等优势。分选后细胞可做进一步分子生物学研究如荧光定量PCR、WB、细胞培养等。
 
分选型流式细胞仪一般由液流系统、光路系统、检测分析系统和分选系统4部分组成。分选功能是通过鞘液流形成的含有细胞的带电液滴而实现的,在流动室的喷嘴上装有一个高速振荡器,该装置充电后以每秒几万次的振动频率使鞘液流成为上万个液滴,细胞在进入液滴之前已经被测定,如果其特性与被选定要进行分选的细胞特性相符,则仪器会对此细胞形成液滴时给整个液柱充以指定的电荷(对标有荧光素的细胞液滴带以负电荷;未标记荧光素的细胞液滴带以正电荷;而不含有细胞的液滴则不被带电荷)。这样,当被选定的细胞形成液滴时就带有特定的电荷,未被选定的细胞和空白液滴不被充电,即不带电荷。当充以不同电荷的含细胞的鞘液流经带有正负几千伏恒定电场的偏转板时,就根据自身所带的电荷性质产生偏差而落入各自的收集管中,不带电荷的液滴就进入废液槽中,从而实现细胞分选的目的。
 
操作流程
1.先制备单细胞悬液(可检测多种样本的单细胞悬液:外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液、实体组织、培养细胞等,如果是无菌实验应该注意无菌操作)
2.样本染色:调节电压与选取目的细胞群(分选前应该做一个预实验,优化仪器的测定条件,建立分选门)
3.细胞分选与收集


流式细胞分选的应用

基于流式细胞术的技术基础,根据颗粒特性实现细胞分选而广泛应用于免疫学、细胞生物学、肿瘤学、血液学、药物开发以及环境检测等各方面科学研究和工作中。例如:
· 用于分选外周血细胞:根据细胞的大小以及颗粒度等特征,对白细胞直接进行分选获取人外周血单核细胞,既避免了多次重复离心,又能分选得到纯度80%-90%之间的单核细胞用于后续实验,为深入研究单核细胞提供了良好的平台;
· 用于分选染色体:能得到高质量的单个染色体,且在实验的同时纯化大量染色体,为后续实验提供了方便;此外还包括干细胞组织研究、移植和细胞治疗研究以及疾病细胞的发生、发展研究等。

 

免疫磁性细胞分选

免疫磁珠细胞分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性抗体结合的特性,在外加磁场中,通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中,而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性抗体结合不具磁性,从而不在磁场中停留达到细胞分离的目的。
磁珠细胞分选所需设备简单,对技术人员要求不高,分选所得细胞灵敏度高、纯度好且细胞活性和复苏率较好,对于下游应用影响较小,应用前景较广。
 

免疫磁性分选策略

免疫磁珠细胞分选依据可以分为两类。一类是根据所标记细胞的不同分为阳性分选和阴性分选;另一类是根据分选方法不同分为直接分选法和间接分选法。
(1)依据标记细胞的不同分类
· 阳性分选:将目的细胞相对应的特异性抗体与磁珠相连后加入混合细胞悬液进行孵育。在抗原抗体发生特异性结合后,以磁分离的方式将目的细胞分离出来
· 阴性分选:从多细胞悬液中分离去除非目的细胞最后得到目的细胞。但在靶细胞的细胞数所占比例比较小时,分选过程中存在的非特异性吸附会直接导致目的细胞的损失。
· 复合分选:是联合两种以上的分选策略进行分选,例如先阴性分选去除非目的细胞,再阳性分选分离目的细胞等。此种方法主要用于细胞亚群的分选或是分离得到高纯度的稀有细胞。
(2)根据不同分选方法分类
· 直接分选法:将抗体或亲和配体直接包被在磁性颗粒上,形成免疫磁性复合颗粒。将其与多细胞悬液混合孵育之后,目的细胞会特异性的结合在免疫磁珠上,在外加磁场的作用下,带有磁珠的目的细胞滞留在磁场中,而非目的细胞则会被去除。
· 间接分选法:目的细胞首先与对应的一抗孵育,激活细胞之后清洗去除未结合的一抗,后再加入预先包被有二抗的磁性颗粒与活化后的细胞进行孵育,一抗与二抗之间的相互作用使得磁粒结合在目的细胞上,同样在磁场作用下滞留目的细胞达到分选目的。

 

细胞分选方法的选择

对于流式细胞分选与免疫磁性细胞分选,不同的分选方式各有优势不能互相取代。流式分选可进行多参数分选以及不同荧光强度的分选,但对设备要求较高,对细胞刺激较大但分选灵活可以达到多方面的分选要求;磁珠分选操作简单,分选速度快,细胞活性好,对设备和技术员的要求较低,但只能通过一种标记进行分选。
如果磁珠分选能达到研究要求,一般首选磁珠分选,若磁珠分选达不到要求则再考虑用流式进行分选。下表为两种分选方法的比较:

比较项目 流式分选 磁珠分选
设备要求 分选型流式细胞仪 专用磁珠分离装置
试剂 荧光素偶联抗体 磁珠结合抗体
操作员要求 要求高,需专门培训 操作简单
对细胞刺激 刺激大 刺激小
多标记识别细胞 可以分选 不可以
多路分选 可以分选 不可以
识别细胞大小和颗粒度 能够识别 不可以
 

 

当有以下几种实验要求时,细胞分选只能采用流式细胞分选而不能采用免疫磁珠细胞分选:
· 当需要非常高纯度(95%-100%)的目标群体时;
· 用于分离其表面上具有低密度受体的群体;
· 根据表面受体密度浓缩表达量不同的群体;
· 基于多色染色分选细胞;
· 基于内部染色(例如DNA或胞内抗原)分选细胞。

参考文献:

[1] 黄莹莹. 流式细胞分选术的应用进展【J】.医学部公共平台
[2] 高敏. 基于金磁微粒的免疫磁性细胞分选方法的建立【J】.中国学位论文全文数据库.2013

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