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siRNA实验原理以及常见问题

siRNA 敲低技术在很多实验中用来评估细胞内蛋白质的功能。这项技术常被用于研究从细胞中去除相应蛋白质之后所产生的变化：

 例如敲低之后是否影响细胞活性？是否为致死敲除？

是否会影响其它蛋白质（尤其是信号转导通路中的蛋白质）的表达水平？

是否影响其它蛋白质在细胞中的位置？以及对细胞表型、形态和功能产生哪些影响？

什么是siRNA ？

小干扰 RNA (siRNA) 是由 20-25 个核苷酸组成的双链 RNA 分子，在细胞中具有多种功能。在 RNA 干扰 (RNAi) 通路中，siRNA 通过与互补 mRNA 分子杂交干扰基因表达。这种干扰会触发 mRNA 降解，进而抑制特定基因的基因表达。

siRNA 于 1999 年由 David Baulcomb 实验室首次发现。2001 年，Thomas Tuschl 提出合成 siRNA 会在哺乳动物细胞中诱导 RNA 干扰 (RNAi)。如今，专门设计用于与 RNA 靶序列杂交并使其降解的“合成”siRNA 寡核苷酸已被广泛用于诱导细胞 RNAi。靶 mRNA 的降解能够有效“敲除”相应蛋白质的表达。然后可研究分析靶蛋白浓度降低造成的影响。

siRNA 的作用原理

 利用短寡核苷酸 siRNA 或能够转录 siRNA 的 DNA 质粒将双链 RNA (dsRNA) 引入细胞。细胞中的 Dicer 蛋白将 dsRNA 消化为 21 bp 的 dsRNA (siRNA)。 siRNA 被整合到 RNA 诱导沉默复合体 (RISC) 中。在 RISC 复合体中，dsRNA 发生链分离。其反义链与细胞中的互补/靶 mRNA 杂交。活化 RISC 中的核酸酶降解靶 mRNA。断裂的 mRNA 无法翻译成蛋白质。也就是说蛋白质无法表达，从而成功“敲除”蛋白质。

敲低效果验证方法：

RT-PCR

检测mRNA，是否仍存在靶 mRNA？或是否敲低成功？

这种方法非常灵敏，但无法准确预测蛋白质水平。

蛋白质印迹实验

使用抗体来检测样品中的靶蛋白表达以及多种相关蛋白质表达，从而观察靶蛋白敲除对其它蛋白质的影响。

免疫细胞化学法

可检测是否存在敲低蛋白。

其优势在于利用双重染色法，可同时检查敲除对其它蛋白质表达的影响以及其它蛋白质在细胞中的位置。