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流式细胞术检测细胞周期和凋亡


流式细胞术检测细胞周期:
细胞周期:指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程,通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期:有丝分裂发生,细胞分裂成两个细胞,进入下一个细胞周期,或者进入静止期(G0期),而G0期从DNA含量上无法与G1期区分,细胞开始RNA和蛋白质的合成,但DNA含量仍保持二倍体。S期:DNA开始合成,细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期:当DNA复制成为4倍体时,细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质,直到进入M期。
PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料,能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合,其结合的量与DNA的含量成正比例关系,用流式细胞仪进行分析,就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态,从而计算出各个期的百分含量。
实验流程:
1  贴壁细胞:
1.1、细胞经过相应的培养刺激后,轻轻去除培养基,加入PBS轻轻摇晃去除PBS;
1.2、加入1ml胰酶,摇晃均匀后放入培养箱中消化(细胞不同消化时间不同);
1.3、消化结束后,将细胞从培养箱中取出,加入3ml含血清的培养基终止胰酶消化,使用移液器将细胞重悬转移至离心管中;
1.4、1000rpm常温离心5min,去除上清,加入3ml PBS重悬细胞,1000rpm常温离心5min,去除上清,加入75%酒精重悬固定细胞,放入4℃冰箱中固定过夜;
1.5、1000rpm常温离心5min,去除上清,加入PBS洗3次,加入PI染色液,37℃染色30min;
1.6、上流式细胞仪检测。
2 悬浮细胞:
2.1、细胞经过相应的培养刺激后,将细胞和培养基全部转移至离心管中,1000rpm常温离心5min,去除上清;
2.2、加入3ml PBS重悬细胞,1000rpm常温离心5min,去除上清;
2.3、加入75%酒精重悬固定细胞,放入4℃冰箱中固定过夜;
2.4、1000rpm常温离心5min,去除上清,加入PBS洗3次,加入PI染色液,37℃染色30min;
2.5、上流式细胞仪检测。
 
细胞凋亡:细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前,因而检测PS的表达,能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,对PS有很高的亲和性,并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理,可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差,因而只能标记坏死的细胞。
实验流程:
1 贴壁细胞:
1.1、细胞经过相应的培养刺激后,将培养基分别转移至离心管中,加入PBS轻轻摇晃去除PBS;
1.2、加入1ml胰酶,摇晃均匀后放入培养箱中消化(细胞不同消化时间不同,使用中不含EDTA胰酶);
1.3、消化结束后,将细胞从培养箱中取出,加入3ml含血清的培养基终止胰酶消化,使用移液器将细胞重悬转移至含培养上清的离心管中;
1.4、1000rpm常温离心5min,去除上清,加入3ml PBS重悬细胞,1000rpm常温离心5min,去除上清,加入1×binding buffer重悬细胞,1000rpm常温离心5min,去除上清,重复该步骤一次;
1.5、100μl 1×binding buffer重悬细胞,每个样本加入5μl AnnexinV和PI染色液,轻轻混匀后室温避光孵育15min;
1.6、1000rpm常温离心5min,去除上清,加入500μl PBS重悬细胞,立刻上流式细胞仪检测。
2 悬浮细胞:
2.1、细胞经过相应的培养刺激后,将细胞和培养基全部转移至离心管中,1000rpm常温离心5min,去除上清,加入3ml PBS重悬细胞,1000rpm常温离心5min,去除上清;
2.2、1000rpm常温离心5min,去除上清,加入3ml PBS重悬细胞,1000rpm常温离心5min,去除上清,加入1×binding buffer重悬细胞,1000rpm常温离心5min,去除上清,重复该步骤一次;
2.3、100μl 1×binding buffer重悬细胞,每个样本加入5μl AnnexinV和PI染色液,轻轻混匀后室温避光孵育15min;
2.4、1000rpm常温离心5min,去除上清,加入500μl PBS重悬细胞,立刻上流式细胞仪检测。

图 A 细胞周期检测图;B 细胞凋亡检测图