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细胞冻存有哪些注意事项?

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细胞培养的传代及日常维持过程中,在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费,而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。


细胞冻存的步骤:
配制含 10%DMSO 或甘油、10~20% 小牛血清的冻存培养液;
取对数生长期的细胞,去除旧培养液,用 PBS 清洗。
去除 PBS,加入适量胰蛋白酶 (覆盖培养皿表面) 把单层生长的细胞消化下来;
离心 1000rpm,5min;
去除胰蛋白酶,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为 5×106/ml~1×107/ml;
将细胞分装入冻存管中,每管 1~1.5 ml;
在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间及操作者;
冻存:标准的冻存程序为降温速率-1~-2℃/ min;当温度达-25℃以下时,可增至-5℃~-10℃/min;到-100℃时,则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱 2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内。


关于细胞冻存的注意事项:
1.  为保持细胞最大存活率,一般都采用慢冻存融的方法。
2.  冻存物距液氮面越近温度越低。标准的低冻速度为-1℃~12℃/ 分钟,当温度下降达-25℃时,下降速度可增至-5~-10℃/ 分钟,到-100℃时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度,过快能影响细胞内水分透出,太慢则促冰晶形成。
3.  初次冻存者在下降冻存时,宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置,然后需用温度计与冻存物并行的办法,以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系,当已掌握以上各参数和冻存技术熟练后,仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。
4.  各种细胞对冻存速度的要求也不一样;上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些,骨髓干细胞-2~-3℃/ 分钟合适;胚胎细胞耐受性较小,不宜太快。总之在一开始时,下降速度不能超过-10℃/ 分钟。
5.  用什么防护剂合适和用量多大,要依细胞而定,初代培养细胞用 DMSO 较好,一般细胞可用甘油;用量以较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在 20%-30% 甘油中很好。
6.  原则上细胞在液氮中可贮存多年,但为妥善起见,冻存一年后,应再复苏培养一次,然后再继续冻存。
7. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤
8. 注意自身的安全,对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中,应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂例如 DMSO,并避免尖锐物品伤人等。