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染色质免疫共沉淀(ChIP检测)


 
染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation),是检测转录因子等蛋白与DNA之间相互作用的主要实验方法之一。在活细胞内使用甲醛将DNA和蛋白交联,使用超声将染色质切成很小的片断,并沉淀下来。通过目的蛋白的抗体将蛋白免疫共沉淀,富集。通过定量PCR检测使用特异性引物对蛋白可能结合的DNA进行扩增检测。
 
实验流程:

1、细胞交联与超声破碎
1 将细胞培养在15cm培养皿中,待细胞长到70%融合度时,根据实验目的进行细胞处理。培养到指定时间点后,去除培养基,加入预冷的PBS洗一次后将细胞消化下来后转移至15ml离心管中,1000rpm离心去除上清,加入5ml PBS缓冲液,加入甲醛至终浓度为1%,室温置于摇床上轻轻晃动20min。加入2.5M Glycine至终浓度0.125M终止交联。在4℃下轻轻晃动10min。在100g,4℃离心5min。弃上清,加入10ml 预冷的PBS洗两次,离心去除上清。
2 加入2 ml cell Lysis Buffer(含2.5 μl 蛋白酶抑制剂)重悬细胞。冰上孵育15min,每隔5min振荡一下细胞悬液。孵育之后,用Dounce匀浆器将细胞悬液匀浆化10次以促进核释放。
3 4℃ 800 g离心5 min。去除上清,用0.5 ml Nuclear Lysis Buffer(含2.5μl蛋白酶抑制剂)重悬细胞。
4 超声破碎:使用超声仪在中档,冲击13s,冰上放置45s,共6次。取5μl细胞裂解液进行电泳检测未打断的DNA。
5 4℃ 12000rpm离心10 min除去不溶解的沉淀。将上清液转移至心的EP管中,分为50μl一份。

2、免疫共沉淀
1每个IP实验需要450μl Dilution Buffer和2.25μl蛋白酶抑制剂。测试样品包括:阳性对照Anti-Histone H3,阴性对照Normal Rabbit IgG,目的抗体。
2 超声好的50μl样本置于冰上,加入450μl稀释液(含2.25μl蛋白酶抑制剂),轻轻混匀后,去除5μl冻存,作为input。
3 分别加入不同抗体和20μl混匀的protein A magnetic beads。
阳性对照抗体,4.0 μg抗体每管。
阴性对照IgG,5.0 μg抗体每管。
目的抗体,每管加5.0 μg抗体。
4 4℃旋转孵育过夜。
5 使用磁力架将Protein A magnetic beads沉淀下来,轻轻去除上清。
6 加入0.5ml预冷的缓冲液,在旋转台上孵育5min后置于磁力架上,去除上清。
7 低盐清洗缓冲液、高盐清洗缓冲液、LiCl清洗缓冲液、TE缓冲液分别洗1次,每次5min。将样本置于磁力架上,去除上清。
8 洗脱Protein/DNA复合物和反交联Protein/DNA复合物为单独的DNA。
9 加入100μl ChIP清洗缓冲液,62℃振荡孵育2 h
10 95℃孵育10 min。然后将样品置于室温冷却。
11 将样本置于磁力架上,将上清液移到一个新的管子中。

3、DNA纯化
1 将0.5 ml Bind Reagent A加入每个100 μl的DNA样品管中并混匀。将样本转移至离心柱上管中,12000rpm离心1min。去除下管液体。
2 加入0.5 ml Wash Reagent至离心柱上管中,12000rpm离心1min。去除下管液体。
3 12000rpm离心2min。丢弃下管。将上管置于新的管中,在离心柱上加入50μl Elution buffer,常温放置2min,12000rpm离心1min。
4 去除离心柱,下管加入20μl洗脱液就是纯化的DNA,直接用于定了PCR检测或存于-20℃。

4、定量PCR检测
1 使用紫外分光光度计检测纯化DNA含量
2 PCR体系:

试剂

体积

DNA

2µL

PCR上游引物(10µM)

0.4 µL

PCR下游引物(10µM)

0.4 µL

SYBR Green solution

10 µL

灭菌双蒸水

7.2 µL

总量

20 µL

 

3 定量PCR检测
反应条件:

95.0 ℃

10min

 

95.0 ℃

15 s

40 cycles

60.0 ℃

1min

95.0 ℃

15 s

melt curve

60.0 ℃

1 min

95.0 ℃

15 s

 

 
 
实验结果示例:

 

图 ChIP检测结果示例图
A ChIP检测DNA跑胶示例图。B ChIP检测结果分析示例图。C ChIP检测扩增曲线示例图。D ChIP检测溶解曲线示例图。

 

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