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慢病毒建立稳转细胞系
 

慢病毒(Lentivirus)是一种逆转录病毒,为双链RNA。不同于一般的病毒,慢病毒具有更广泛的宿主,对正在分裂的细胞和非分裂的细胞均具有感染能力。重组慢病毒载体是以HIV-1为基础,使用疱疹病毒VSVG 外壳蛋白发展起来的工具载体,其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代,属于假型病毒。慢病毒可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而可以在宿主细胞中持久性表达。
目前实验使用的病毒主要为慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒。
慢病毒与其他病毒比较,具有以下优势:
1安全性高:由于慢病毒剔除毒性基因,目前实验未发现致病性,已被用于CAR-T治疗于人体;
2 表达时间长:慢病毒通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上,可实现目的基因长时间稳定的表达,不随着细胞分裂传代而丢失,是细胞实验的首选;
3 免疫原性低: 直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验。
 
实验流程
1 慢病毒包装:公司使用3质粒慢病毒包装系统,慢病毒系统使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G,过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统,将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法瞬时转染至HEK293T细胞中,轻轻混匀后放入培养箱中培养48h后,收集上清。使用genecopoeia公司慢病毒颗粒纯化试剂盒将慢病毒纯化。纯化后留取部分检测病毒滴度,其余病毒冻存于-80℃冰箱中。
2 滴度检测:将病毒颗粒使用梯度稀释,分别感染293T细胞,感染72h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。
3 细胞感染:在病毒感染前一天对细胞进行计数,接种约10000个细胞于12孔板中,培养过夜后使用无血清培养基稀释病毒,加入12孔板中对细胞进行感染,病毒数量根据推荐细胞的感染MOI加入(若无推荐MOI,需做病毒梯度:1,5,10,50,100 5个梯度对细胞感染),感染6h后去除含病毒溶液,加入完全培养基细胞培养,培养48h后,在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选,筛选约2周时间。细胞筛选好后,使用定量PCR和Western blot检测目的基因的稳定表达情况。

结果示例:

图 病毒感染后细胞荧光示例图
A MOI检测,不同浓度病毒对细胞感染后,荧光表达变化。B 2种贴壁细胞病毒感染后荧光表达情况