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关于荧光定量PCR检测


关键词:第三方检测机构  pcr  基因检测  检测  pcr实验室  pcr技术  荧光定量pcr  第三方检测中心
 
1. 简介
 
聚合酶链式反应 (PCR) 是分子生物学领域功能最强大的技术之一。采用 PCR 技术,利用序列特异性寡核苷酸、热稳定性 DNA 聚合酶和热循环,可将 DNA 或 cDNA 模板内的特异性序列拷贝或“扩增”数千至数百万倍。在传统(终点) PCR 中,扩增序列的检测和定量是在反应结束,即最后一次 PCR 循环完成后进行的,且需要 PCR 后分析,
 
 
利用具有热循环功能及荧光染料筛查能力的仪器,检测反应过程中荧光的变化。实时荧光定量 PCR 仪通过绘制荧光与循环数曲线,生成扩增曲线,表示在整个 PCR 反应过程中积聚的产物 (图 1)。
实时荧光定量 PCR 的优点包括:
 
如凝胶电泳和图像分析。在实时荧光定量PCR (qPCR) 中, 每次循环均检测PCR产物。通过监测指数扩增期的反应, 用户可以确定靶点的起始量,且精度极高。
在理论上,PCR 可呈指数型扩增DNA,使每个扩增循环中的靶分子数倍增。在 PCR 问世之初,科学家推断,通过与已知标准品进行比较,利用循环数和 PCR 终产物的量可以计算出遗传物质的起始量。为达到可靠定量的要求,实时荧光定量 PCR 技术得以问世。如今终点 PCR 主要用于扩增特定的 DNA,用于测序、克隆及其它分子生物学技术。
在实时荧光定量 PCR 中,每次循环结束后通过荧光染料检测 DNA 的量,荧光染料产生的荧光信号与生成的 PCR 产物分子 (扩增片段) 数直接成正比。利用反应指数期采集的数据,生成有关扩增靶点起始量的定量信息。实时荧光定量 PCR 使用的荧光报告基团包括双链 DNA (dsDNA) 结合染料或在扩增过程中掺入 PCR 产物的、与 PCR 引物或探针结合的染料分子。
• 能够实时监控 PCR 反应的进程
• 能够精确测定每个循环的扩增片段数量,从而对样本中的起始材料量进行准确定量
• 具有更大的检测动态范围
• 在单管中实现扩增和检测,无需 PCR 后处理
在过去的数年中,实时荧光定量 PCR 已成为 DNA 或 RNA 检测和定量的主要工具。采用上述技术,您可以实现精确的检测,其准确度低至2倍范围,起始材料的动态范围达
6 至 8 个数量级。
 
 
图 1. 相对荧光与循环数。 通过绘制每个样本的荧光信号与循环数曲线,生成扩增曲线;因此,扩增曲线表示在实时荧光定量 PCR 实验过程中积聚的产物。用于创建本图曲线的样本是连续梯度稀释的 DNA 靶序列。
 
 
2.实时荧光定量 PCR 概述
本部分将概括实时荧光定量 PCR 的步骤。实时荧光定量
PCR 是在标准 PCR 技术基础上演变而成,常用于定量样本中的 DNA 或 RNA。利用序列特异性引物,可测定特定的 DNA 或 RNA 序列的拷贝数。通过检测 PCR 循环的每个阶段中扩增产物的量,实现定量。如果样本中存在高丰度的特定序列 (DNA 或 RNA),则在早期循环中即可观察到扩增;如果序列较少,则在晚期循环中方可观察到扩增。
利用荧光探针或荧光 DNA 结合染料,采用实时荧光定量
PCR 仪检测荧光并完成 PCR 反应所需的热循环,实现扩增产物的定量。
 
实时荧光定量PCR 的步骤
实时荧光定量 PCR 反应的每个循环包括三个主要步骤。一般运行 40 个循环。
1. 变性:利用高温孵育将双链 DNA“熔解”为单链,并松开单链 DNA 的二级结构。一般采用 DNA 聚合酶可耐受的最高温度 (通常为 95°C)。如果模板 GC 含量较高,则延长变性时间。
2. 退火:在退火过程中,互补序列有机会发生杂交,因此,应根据计算所得的引物熔解温度 (Tm),使用适当的温度 (通常较引物的 Tm 低 5°C)。
3. 延伸:在 70-72°C 之间,DNA 聚合酶的活性最佳,引
物延伸速度达每秒 100 个碱基。当实时荧光定量 PCR 中的扩增片段较小时,通常将该步骤与退火步骤合 并,温度为 60°C。
采用了随机引物或 oligo(dT) 和随机引物的混合物。
cDNA 合成采用的温度取决于所选的 RT 酶。逆转录完成后,将约 10% 的 cDNA 转移至单独的管中,完成实时荧光定量 PCR 反应。

两步法qRT-PCR
两步法定量逆转录 PCR (qRT-PCR) 的第一步是采用逆转录酶 (RT) 将总 RNA 或 poly(A) RNA 逆转录为 cDNA。采用随机引物、oligo(dT) 或基因特异性引物 (GSP) 完成第一链
cDNA 合成反应。为在实时荧光定量 PCR 应用中平均表示所有靶点并避免 oligo(dT) 引物的 3’ 偏差,许多研究人员
 
扩增;如果序列较少,则在晚期循环中方可观察到扩增。
利用荧光探针或荧光 DNA 结合染料,采用实时荧光定量
PCR 仪检测荧光并完成 PCR 反应所需的热循环,实现扩增产物的定量。

一步法qRT-PCR
一步法 qRT-PCR 可在同一管内完成第一链 cDNA 合成反应和实时荧光定量 PCR 反应,简化了反应设置,并降低了污染的可能性。需要使用基因特异性引物 (GSP)。这是由于在一步法操作中使用 oligo(dT) 或随机引物将生成非特异性产物,降低了目的产物的量。