关于siRNA 转染
关键词：细胞实验外包 细胞培养 实验室 细胞转染 质粒转染 脂质体转染 第三方检测机构
什么是 RNA 干扰？
RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。它是指小分子双链 RNA 可以特异性地降解同源 mRNA，从而抑制或关闭特定基因表达的现象。只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因 mRNA 的小分子干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病 mRNA 的表达。siRNA 是目前最为热门的生命科学研究领域之一，也是未来最有发展前途的新药开发领域。siRNA 转染实验逐渐成为生命科学研究中常见手段。
siRNA转染的特点
因为 siRNA 与 DNA 表面均呈现负电荷，自身无法内吞进入细胞，所以要将 siRNA 转染进入细胞理论上也可采取以下几种方法：化学转染、电穿孔、磷酸钙共沉淀、显微注射等方法，其中化学转染技术是目前最为常用的方法。而化学转染试剂又可分为脂质体、聚合物、多肽及其他各种纳米材料，各种转染试剂虽然材料不同，但是作用机制上却并无区别，均采用电荷吸附作用装载核酸，将核酸转染进入细胞。
siRNA 通常是一段长 20-25 个核苷酸的双股 RNA（dsRNA），虽然与质粒一样都是核酸但是却有很大不同：第一，结构大小上有很大差别，质粒往往有数千个碱基对而 siRNA 一般只有 21 个碱基对，相差数百倍；第二，结构稳定性上有很大不同，siRNA 作为核糖核苷酸比脱氧核糖核苷酸更容易被降解，极不稳定；第三，siRNA 与质粒在转染实验中的发挥作用的位置不同，siRNA 要在细胞质中发挥作用。这些区别导致 siRNA 的转染实验不能盲目照搬质粒转染实验的经验，转染方法、转染试剂等都需要根据 siRNA 的特点来选择。
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DNA |
siRNA |
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碱基对 |
数千 |
~21 |
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稳定性 |
较稳定 |
稳定性较差，极易被RNA酶降解 |
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作用部位 |
细胞核 |
细胞质 |
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转染试剂作用原理 |
静电作用 |
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转染试剂电荷强度 |
较强 |
较弱 |
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转染效率分析 |
荧光显微镜 |
qPCR |
siRNA 转染试剂与 DNA 转染试剂是否通用？
因为上述 siRN A与 DNA 在结构上以及作用机制上的巨大区别，所以 DNA 和 siRNA 的转染试剂并不通用，DNA 转染试剂（比如Lipofectamine 2000，Lipofectamine 3000）可以在一定程度上进行 siRNA 的转染，但是其效果无法达到最佳。为了充分包裹分子量较大的 DNA，DNA 转染试剂一般电荷强度极高，而这种高电荷强度的试剂在进行 siRNA 转染时将导致 siRNA 无法从转染试剂中完全释放出来以至于不能充分发挥作用（即使 siRNA 已经进入细胞）；其次，这种高电荷强度也会给细胞带来一定的毒性。所以 Lipo2000、Lipo3000 等产品虽然可以实现 siRNA 和 DNA 的共转染，但是对于单独 siRNA 的转染并不是最佳选择，InvitroRNA™ 等 RNA 专用转染试剂对细胞更佳温和、转染效率更高，显著优于 lipo2000 等产品（如下图）。
siRNA 转染效率的检测方法
转染效率的确定，最可靠最精确的方法无疑是检测目的基因的 mRNA 水平。有些初学者习惯使用荧光显微镜来判断转染效率，这其中存在诸多问题。采用荧光观察 siRNA 的转染往往是在 siRNA 上标记荧光分子，这至少存在三个误区：一是荧光显微镜看到的荧光强度不能代表进入细胞的 siRNA 的量，因为非特异性吸附在细胞表面的 siRNA 也同样发光；二是进入细胞的 siRNA 与转染效率并不直接相关，有些转染试剂能够将 siRNA 转入细胞，但不能充分释放，导致基因抑制效率并不高；三是荧光基团修饰的 siRNA 与未修饰的 siRNA 是两个不同的分子，荧光基团引起 siRNA 分子性质发生变化，导致转染效率可能存在差别。所以不能简单的仅靠观察荧光显微镜判断转染效率、选择转染试剂，这往往会导致误判，影响实验的进展。
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