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辅助降糖功能评价动物实验方法

1 实验项目
1.1 正常动物降糖实验
选择健康成年动物,按空腹3-5小时血糖水平分组,随机选择1个对照组和1个剂量组。对照组给予溶剂,剂量组给予高剂量浓度测试样品连续30天测量空腹血糖值(空腹与实验前相同),比较两组动物。
1.2 高血糖模型降血糖实验
1.2.1 胰岛损伤高血糖模型
1.2.1.1 原理:四氧嘧啶(或链脲佐菌素)是一种细胞毒剂,可选择性地损伤一个物种的多个胰岛细胞,导致胰岛素分泌低,引起实验性糖尿病。
1.2.1.2 建模方法
购买成年动物,适应1天后,随机选择15只动物禁食3-5小时,测定空腹血糖作为该批动物的基础血糖值。然后将动物禁食24小时(自由饮水)并注射四氧嘧啶(使用前新鲜制备)建立模型,小鼠45-50 mg/kg BW.iv,50-80 mg/kg BW.iv老鼠。 5-7天后,动物禁食3-5小时,测量血糖。血糖水平为10-25 mmol/L,是成功的高血糖动物模型。选取高血糖模型动物,按空腹3~5小时血糖水平分组,随机选取1个模型对照组和3个剂量组(组间差异不大于1.1 mmol/L)。剂量组给予不同浓度的试验样品,模型对照组给予溶剂连续30天测量空腹血糖值(空腹与实验前相同),比较血糖值,百分比各组血糖下降,并进行糖耐量试验。
1.2.2 地塞米松诱导的胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型
1.2.2.1 原理:糖皮质激素可拮抗胰岛素的生物学作用,抑制靶组织对葡萄糖的摄取和利用,促进蛋白质和脂肪的分解和糖异生,糖异生导致糖脂代谢紊乱,胰岛素抵抗,诱导实验糖尿病。
1.2.2.2 试验方法:购买健康雄性大鼠(15020g),正常维持日粮适应喂食3-5天,禁食3-4小时,采尾血测空腹前(0小时)、2.5g/kg BW后血糖水平葡萄糖,测量0.5和2小时的血糖值,作为该批动物的基准值。根据0、0.5小时血糖水平分为5组,即1个空白对照组、1个模型对照组和3个剂量组,每组15只大鼠。空白对照组不做任何处理,三个剂量组灌胃不同浓度的试验样品,模型对照组连续35天给予相同体积的溶剂。每组喂食维持饲料。 1周后,模型对照组和3剂组换成高热量饲料。喂养2周后,模型对照组和3剂组在高热量饲料的基础上给予地塞米松0.8mg。 /kgBW腹腔注射,每天一次,连用10-12天。试验结束时,各组动物禁食3-4小时,检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素、胆固醇和甘油三酯水平。
1.2.3 四氧嘧啶诱导的胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型
1.2.3.1 原理:在高热量饲料的基础上,辅以低剂量四氧嘧啶,会引起糖/脂代谢紊乱,胰岛素抵抗,诱发实验性糖尿病。
1.2.3.2 造模方法:购入健康雄性大鼠(15020g),适应普通维持物喂养3-5天,禁食3-4小时,取尾血,葡萄糖给药前(即0小时)测量。以2.5g/kg BW葡萄糖给药后0.5和2小时的血糖值作为本批动物的基础值。根据0、0.5小时血糖水平分为5组,即1个空白对照组、1个模型对照组和3个剂量组,每组15只大鼠。空白对照组不做任何处理,三个剂量组灌胃给予不同浓度的供试品,模型对照组连续给予等体积溶剂33天。每组喂食维持饲料。 1周后,模型对照组和3个剂量组换成高热量饲料。喂食3周后,模型对照组及3剂禁食24小时(禁水),给予四氧嘧啶103 -105mg/kg BW腹腔注射,注射量1ml/100g 体重。注射后3-5天继续喂高热量饲料。实验结束时,各组动物禁食3-4小时,检测空腹血糖、糖耐量、血清胰岛素、胆固醇和甘油三酯水平。
2 实验原理
2.1 动物实验和人体食品试验所列指标均为强制性项目。
2.2 根据被测样品作用原理的不同,可选择方案1和方案2的动物模型中的一种进行动物实验。
2.3 高血糖模型动物除检测所列指标外,还应观察供试品对正常动物空腹血糖的影响。
3 结果的确定
3.1 动物实验:
方案一:若空腹血糖和糖耐量两项指标之一为阳性,且对正常动物的空腹血糖无影响,则可判定供试品有助于降低血糖功能性动物的结果实验是积极的。
方案二:若空腹血糖和糖耐量两项指标之一为阳性,血脂(总胆固醇、甘油三酯)无明显升高,对正常动物空腹血糖无影响,则供试品可确定辅助降糖功能的动物实验结果为阳性。