分子生物学平台

动物模型构建平台
组织病理学平台
细胞生物学平台
分子生物学平台
其它专项检测平台

联系我们

CONTACT US

联系我们

  服务热线

025-58651876

  联系电话

025-58651876

  公司地址

江苏省南京市栖霞区和燕路371号 东南大学国家大学科技园科创楼A301

分子生物学平台

新冠病毒核酸RT-PCR检测



 图片5.png

新冠病毒

新型冠状病毒(严重急性呼吸道综合征冠状病毒2Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2),最初发现于2019年,也可称为2019新型冠状病毒。是乙型冠状病毒中的一个分型,与2003SARS病毒相似。该病毒株以前从未在人体中发现,人感染后会出现呼吸道症状、咳嗽、发烧、呼吸困难,部分患者嗅觉味觉消失,严重的病例中出现严重的呼吸综合征、肺炎、肺纤维化、肾衰竭,甚至死亡。该病毒主要通过上呼吸道入侵人体,主要感染肺、心脏、肾等多种器官。

该病毒具有包膜的、不分节段的正链单股RNA病毒,颗粒呈圆形或椭圆形,直径约80120nm。具有包膜的正链单链RNA病毒,较容易突变,目前多种变种在全球发现。

目前病毒检测主要是核酸检测和抗原检测。核酸检测在病毒感染后就可以检测出,是检测病毒感染与否的直接证据,抗原抗体检测是患者感染3d后出现抗体,是检测病毒感染的间接证据。

核酸检测主要是通过实时荧光定量PCR检测新冠病毒保守的片段区域的序列,以确定体内是否含有该病毒。当定量PCR检测出有该序列,说明有可能感染了病毒,会通过多次PCR进行检测并结合临床检测指标进行确诊。

实时荧光定量PCR使用Taqman法进行检测,使用针对病毒2个或更多的保守区域特异性引物和探针(不同国家或地区检测的区域不一致,我国主要是检测ORF1abN区域这2个保守区域)

 1640941919719937.png

图片9.png

1 新冠病毒基因组图及PCR靶基因检测区域

 

 1640942005589582.png

2 核酸检测流程(据Enzolifesciences

咽拭子样本采集后运送至实验室生物安全柜中直接进行下列处理,样本也可以在4℃冰箱中储存不超过7天。

1)预处理:样本中加入Remel Sputasol (Thermo Fisher Scientific)对粘性样本进行预处理。

2)病毒灭活:将50μl样本在99℃加热5min,将病毒灭活。将样本转移至离心机中4000rpm离心5min。(有的试剂盒需要提取核酸)

3)逆转录+PCR检测:取5μl样本加入逆转录和PCR反应体系中。

反应体系包含:逆转录酶、DNA聚合酶、特异性引物、特异性probe,并使用乙肝病毒HBVS抗原序列作为内控。


PCR mix体系

成分

体积(μl

RT-PCR mix

12.5

forward primer

400nM

reverse primer

400nM

PCR probe

200nM

sample

5

Rnase free H2O

up to 25

total

25

 

PCR反应程序

程序

温度

时间


循环数

逆转录

99

30s

变性

1cycle

60

5min

逆转录

PCR

90

5s

变性

45cycle

60

30s

退火/延伸

 

4)结果判读:

PCR检测结束后,定量PCR仪会有每个样本检测的Ct值,当检测样本两个检测位点无Ct值或者>38时,判断为阴性,当两个检测位点Ct<38时,是阳性,当两个检测位点Ct值在38左右不一致是,需要再次进行复检。

Ct值阳性时,医生会结合流行病学接触史和影像学检查结合进行综合判断。

 更多相关文章:PCR检测报告案例 关于PCR检测

 


CHIRP 检测 没有了!