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细胞转染实验




一、实验目的

 

学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的一般性方法,观测外源蛋白的表达(绿色荧光蛋白),为染色准备实验材料。

 

二、实验原理

 

 

上图所示是脂质体介导转染的示意图,它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。

 

外源基因进入细胞主要有四种方法:电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入;磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞;病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大;病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响;所以现在对于很多普通细胞系,一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。

 

利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性,因此脂质体与质粒的比例,细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题,通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。

 

 

上图是本次实验采用的脂质体中阳离子组分的结构的示意图。

 

本次实验采用的脂质体是promega公司的TransFast脂质体试剂,它是一种阳离子脂质体和中性脂质体的混合物,是对于本次实验中采用的293T细胞优化的转染试剂。

 

三、实验材料与器材

 

1、材料

293T细胞

MyoD表达质粒和EGFP表达质粒

DMEM培养基

链霉素/青霉素(双抗)

FCS(小牛血清)

PBS(磷酸盐缓冲溶液)

胰酶/EDTA消化液

转染试剂(TransFast