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什么是脂质体?脂质体转染的原理和步骤?

 关键词:细胞实验外包  细胞培养  实验室  细胞转染  质粒转染 脂质体转染 第三方检测机构 

 
细胞转染的方法主要包括:电穿孔法、显微注射、基因枪、磷酸钙共沉淀法、脂质体转染法、多种阳离子物质介导、病毒介导的转染等,理想的细胞转染方法是具有高转染效率、对细胞的毒性作用小等。
 
一、脂质体 (liposome) 转染方法原理
脂质体 (liposome) 转染方法原理:脂质体 ((Iiposome) 作为体内和体外输送载体的工具,已经研究的十分广泛,用合成的阳离子脂类包裹 DNA,同样可以通过融合而进入细胞。使用脂质体将 DNA 带入不同类型的真核细胞,与其它方法相比,有较高的效率和较好的重复性。
中性脂质体是利用脂质膜包裹 DNA,借助脂质膜将 DNA 导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体,DNA 并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电的 DNA 自动结合到带正电的脂质体上,形成 DNA-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞被导入细胞。
二、脂质体转染操作步骤
1、操作步骤 [方法一]:
(1) 细胞培养:取 6 孔培养板 (或用 35 mm 培养皿),向每孔中加入 2 mL 含 1~2×105 个细胞培养液,37℃ CO2 培养至 40%~60% 汇合时 (汇合过分,转染后不利筛选细胞)。
(2) 转染液制备:在聚苯乙稀管中制备以下两液 (为转染每一个孔细胞所用的量)A 液:用不含血清培养基稀释 1-10 μg DNA,终量 100μL,B 液:用不含血清培养基稀释 2-50 μgLR,终量 100μL,轻轻混合 A、B 液,室温中置 10-15 分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染 (如出现沉淀可能因 LR 或 DNA 浓度过高所致,应酌情减量)。
(3) 转染准备:用 2 mL 不含血清培养液漂洗两次,再加入 1 mL 不含血清培养液。
(4) 转染:把 A/B 复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃ 温箱置 6~24 小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。
(5) 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。
注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。

2、快速脂质体转染法操作步骤如下 [方法二]:
(1) 以 5×105 细胞/孔接种 6 孔板 (或 35 mm 培养皿) 培养 24 小时,使其达到 50~60% 板底面积。
(2) 在试管中配制 DNA/脂质体复合物方法如下:
①在 1 mL 无血清 DMEM 中稀释 PSV2-neo 质粒 DNA 或供体 DNA。
②旋转 1 秒钟,再加入脂质体悬液,旋转。
③室温下放置 5~10 分钟,使 DNA 结合在脂质体上。
(3) 弃去细胞中的旧液,用 1 mL 无血清 DMEM 洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入 1 mL DNA/脂质体复合物,37℃ 培养 3~5 小时。
(4) 再于每孔中加入 20%FCS 的 DMEM,继续培养 14~24 小时,
(5) 吸出 DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜 10%FCS 的 DMEM,2 mL/孔,再培养 24~48 小时。
(6) 用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。

3、稳定的脂质体转染方法如下:
(1) 接种细胞同前,细胞长至 50% 板底面积可用于转染。
(2)DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前 (2)、(3) 步骤。
(3) 在每孔中加入 1 mL、20%FCS 的 DMEM,37℃ 培养 48 小时。
(4) 吸出 DMEM,用 G418 选择培养液稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染克隆,方法参照细胞克隆筛选法进行。

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