在细胞实验中，如何提高细胞冻存后的复苏存活率？

细胞冻存后复苏的存活率，直接影响后续实验的质量和可靠性。提高细胞冻存后的复苏存活率可以从我冻存、复苏以及后处理三个方面进行优化。

 一、冻存阶段

1.选择合适的冻存液：

最常见：90% FBS + 10% DMSO

有些细胞（如干细胞）推荐使用商业化冻存液（如StemCell BankIt、Gibco Recovery™）

2.细胞状态要好：

冻存前最好处于对数生长期，活力高

死细胞或过度融合的细胞难以复苏

3.细胞浓度合适：

推荐密度：1×10⁶～5×10⁶ cells/mL，太稀不易成活，太密会营养竞争

4.降温速度要慢（-1°C/min）：

使用程序降温盒（如Nalgene Mr. Frosty）+ -80°C冷冻一晚

然后转入液氮罐（长期保存）

 二、复苏阶段

1.快速解冻：

将冻存管迅速置于 37°C水浴中摇晃，约1分钟解冻完毕

减少细胞处于0～15°C之间的时间，防止形成冰晶

2.立即稀释 DMSO：

解冻后马上转入预热的培养基中缓慢滴加（防止渗透压冲击）

可用 10mL完全培养基稀释，1000 rpm 离心3-5 min 去除 DMSO

3.培养基要“温暖而新鲜”：

用新配好的完全培养基，含10% FBS

可添加少量抗生素以防止污染（但不建议长期用）

 三、后处理和养护

1.不要急于换液：

复苏24小时内尽量不换液，给细胞“喘息时间”

2.密度不能太低：

密度过低影响贴壁/生长，复苏后可适当密植

3.加入细胞保护剂（可选）：

如：ROCK 抑制剂 Y-27632（用于hESC/iPSC），可明显提高复苏效率

 补充注意事项：

贴壁细胞复苏后可能贴得慢，不要急于判断死亡

有些敏感细胞系冻存时可适当加 葡萄糖/丙酮酸钠/甘油三酯等作为辅助保护

如果复苏率依旧低，可尝试：

冻存时加 抗氧化剂（如NAC）

使用 专用冻存试剂盒